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+# Tutorial para iniciantes do Piximi (Portugues)
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+## Segmentação e classificação sem instalação no navegador
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+Beth Cimini, Le Liu, Esteban Miglietta, Paula Llanos, Nodar Gogoberidze
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+Instituto Broad do MIT e Harvard, Cambridge, MA.
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+### **Informações básicas:**
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+#### **O que é Piximi?**
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+Piximi é uma ferramenta moderna de análise de imagens sem programação que utiliza aprendizado profundo. Implementado como um aplicativo web em [https://piximi.app/](https://piximi.app/), o Piximi não requer instalação e pode ser acessado por qualquer navegador moderno. Sua arquitetura exclusiva para clientes preserva a segurança dos dados do pesquisador, executando toda a computação localmente.
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+O Piximi é interoperável com ferramentas e fluxos de trabalho existentes, suportando importação e exportação de dados e formatos de modelos comuns. A interface intuitiva e o fácil acesso ao Piximi permitem que pesquisadores obtenham insights sobre imagens em apenas alguns minutos. O Piximi visa levar a análise de imagens com aprendizado profundo a uma comunidade mais ampla, eliminando barreiras.
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+\* exceto as segmentações usando Cellpose, que são enviadas para um servidor remoto (com a permissão do usuário).
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+Funcionalidades principais: **Anotador, Segmentador, Classificador, Medições.**
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+#### **Objetivo do exercício**
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+Neste exercício, você se familiarizará com as principais funcionalidades do Piximi: anotação, segmentação, classificação, mensuração e visualização, e o utilizará para analisar um conjunto de imagens de um experimento de translocação. O objetivo deste experimento é determinar a **menor dose efetiva** de Wortmannin necessária para induzir a localização nuclear de FOXO1A marcada com GFP (Figura 21). Você segmentará as imagens usando um dos modelos de aprendizado profundo disponíveis no Piximi, verificará e selecionará a segmentação e, em seguida, treinará um classificador de imagens para classificar as células individuais como tendo "GFP nuclear", "GFP citoplasmática" ou "sem GFP". Por fim, você fará medições e as plotará para responder à pergunta biológica.
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+#### **Contexto do experimento**
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+Neste experimento, pesquisadores obtiveram imagens de células U2OS de osteossarcoma (câncer ósseo) fixadas expressando uma proteína de fusão FOXO1A-GFP e coraram DAPI para marcar os núcleos. FOXO1 é um fator de transcrição que desempenha um papel fundamental na regulação da gliconeogênese e glicogenólise por meio da sinalização da insulina. FOXO1A transita dinamicamente entre o citoplasma e o núcleo em resposta a vários estímulos. A wortmanina, um inibidor da PI3K, pode bloquear a exportação nuclear, resultando no acúmulo de FOXO1A no núcleo.
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+```{figure} ./img/tutorial_images/Figure1.png
+:largura: 300
+:alinhar: centro
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+Representação esquemática do mecanismo FOXO1A
+```
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+#### **Materiais necessários para este exercício**
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+Os materiais necessários para este exercício podem ser baixados de: [PiximiTutorial](./downloads/Piximi_Translocation_Tutorial_RGB.zip). O arquivo “Piximi Translocation Tutorial RGB.zip” contém um projeto Piximi, incluindo todas as imagens, já rotuladas com o tratamento correspondente (concentração de Wortmannin ou Controle). Baixe este arquivo, mas **NÃO o descompacte**!
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+#### **Instruções do exercício**
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+Leia os passos abaixo e siga as instruções onde indicado. Os passos em que você precisa encontrar uma solução estão marcados com 🔴 PARA FAZER.
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+##### 1. **Carregue o projeto Piximi**
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+🔴 PARA FAZER
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+* Inicie o Piximi acessando: [https://piximi.app/](https://piximi.app/)
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+* Carregue o projeto de exemplo: Clique em “Abrir” \- “Projeto” \- “Projeto do Zip”, como mostrado na figura 22, para carregar um arquivo de projeto para este tutorial do Zip. Você também pode alterar o nome do projeto no painel superior esquerdo, como “Exercício Piximi”. Conforme ele é carregado, você pode ver a progressão no logotipo <img src="./img/tutorial_images/Piximi_logo.png" width="80"> no canto superior esquerdo.
+
+```{figure} ./img/tutorial_images/Figure2.png
+:width: 600
+:align: center
+
+Carregando um arquivo de projeto.
+```
+
+##### 2. **Verifique as imagens carregadas e explore a interface do Piximi**
+
+Estas 17 imagens representam tratamentos com Wortmannin em oito concentrações diferentes (expressas em nM), bem como tratamentos controles (0 nM). Observe que o canal DAPI (Núcleos) é mostrado em magenta e que o canal GFP (FOXOA1) é mostrado em verde.
+
+Ao passar o mouse sobre a imagem, rótulos coloridos são exibidos no canto esquerdo das imagens. Essas anotações são dos metadados do arquivo compactado que acabamos de enviar. Neste tutorial, os diferentes rótulos coloridos indicam a concentração de Wortmannin, enquanto os números representam o número de imagens em cada categoria.
+
+Opcionalmente, você pode anotar as imagens manualmente clicando em "+ Categoria", inserindo seu rótulo e, em seguida, selecionando a imagem clicando nas imagens e anotando as imagens selecionadas clicando em **"Categorizar"**. Neste tutorial, pularemos esta etapa, pois os rótulos já foram carregados no início.
+
+```{figure} ./img/tutorial_images/Figure3.png
+:largura: 600
+:alinhar: centro
+
+Explorando as imagens e rótulos.
+```
+
+##### 3. **Segmentar Células - descubra as células a partir do fundo**
+
+🔴 PARA FAZER
+
+* Para iniciar a previsão em todas as imagens, clique em “Selecionar Todas as Imagens” no painel superior, conforme mostrado na Figura 23.
+* Altere a Tarefa de Aprendizagem para “SEGMENTAÇÃO” (Figura 24, Seta 1).
+
+* Clique em “+ CARREGAR MODELO” (Seta 2) e a janela será exibida, permitindo que você escolha um modelo pré-treinado (Seta 3). Para o exercício de hoje, selecione “Cellpose” (Seta 4). Mais informações sobre o modelo suportado podem ser encontradas [aqui](https://documentation.piximi.app/segmentation.html).
+* Clique em “Abrir Modelo de Segmentação” (Seta 5) para carregar seu modelo e selecioná-lo. Por fim, clique em “Prever Modelo” (Seta 5). Você verá o progresso da previsão exibido no canto superior esquerdo, abaixo do logotipo da Piximi <img src="./img/tutorial_images/Piximi_Progress_logo.png" width="140">.
+* A segmentação levará alguns minutos para ser concluída.
+
+```{figure} ./img/tutorial_images/Figure4.png
+:width: 600
+:align: center
+
+Carregando um modelo de segmentação.
+```
+
+Observe que as etapas anteriores foram executadas em sua máquina local, o que significa que suas imagens estão armazenadas localmente. No entanto, a inferência do Cellpose é executada na nuvem, o que significa que suas imagens serão enviadas para processamento. Se suas imagens forem altamente sensíveis, tenha cuidado ao usar serviços baseados em nuvem.
+
+##### 4. **Visualize o resultado da segmentação e corrija os erros de segmentação**
+
+🔴 PARA FAZER
+
+* Clique na aba **CELLPOSE_CELLS** para verificar as células individuais que foram segmentadas. Clique na aba “IMAGEM” e depois em “Anotar” para verificar a segmentação de toda a imagem.
+
+```{figure} ./img/tutorial_images/Figure5.png
+:largura: 600
+:alinhar: centro
+
+Ferramenta de anotação do Piximi.
+```
+
+* Opcionalmente, aqui você pode refinar manualmente a segmentação usando as ferramentas do anotador. O anotador Piximi oferece diversas opções para **adicionar**, **subtrair** ou **interseccionar** anotações. Além disso, a **ferramenta de seleção** permite **redimensionar** ou **excluir** anotações específicas. Para começar a editar, selecione imagens específicas ou todas clicando na caixa de seleção na parte superior.
+* Opcionalmente, você pode ajustar os canais: embora existam dois canais neste experimento, o sinal dos núcleos é duplicado nos canais vermelho e verde. Este projeto foi projetado para ser **compatível com daltonismo** e produzir uma **cor magenta** para os núcleos. O **canal verde** também inclui sinais citoplasmáticos.
+
+Outro motivo para duplicar os canais é que alguns modelos — como o **modelo Cellpose** que usamos hoje — exigem uma entrada de **três canais**.
+
+* Você pode optar por segmentar manualmente as células para gerar máscaras para dados de verdade básica.
+
+##### **Classificar células**
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+Motivo para isso: Queremos classificar as 'CELLPOSE\_CELLS' com base na distribuição de GFP (em núcleos, citoplasma ou sem GFP) sem rotular todas elas manualmente. Para isso, podemos usar a função de classificação do Piximi, que nos permite treinar um classificador usando um pequeno subconjunto de dados rotulados e, em seguida, classificar automaticamente as células restantes.
+
+🔴 PARA FAZER
+
+* Acesse a aba **CELLPOSE_CELLS** que exibe os objetos segmentados (seta 1, figura 26)
+* Clique na aba **Classificação** no painel esquerdo (seta 2, figura 26).
+* Crie novas categorias clicando em **“+ Categoria”**. Adicione as três categorias “Cytoplasmatic_GFP”, “Nuclear_GFP” e “No_GFP” (Seta 3, Figura 26).
+* Clique nas imagens que correspondem aos seus critérios. Você pode selecionar várias células pressionando **Command (⌘)** no Mac ou **Shift** no Linux. Tente atribuir **\~20–40 células por categoria**. Após selecionar, clique em **“Categorizar”** para atribuir os rótulos às células selecionadas.
+
+```{figure} ./img/tutorial_images/Figure6.png
+:width: 600
+:align: center
+
+Classificando células individuais com base na presença e localização de GFP.
+```
+
+##### 6. **Treine o modelo do Classificador**
+
+🔴 PARA FAZER
+
+* Clique no ícone "<img src="./img/tutorial_images/Fit_model.png" alt="Fit model icon" width="20px"> - Ajustar Modelo" para abrir as configurações de hiperparâmetros do modelo. Para o exercício de hoje, ajustaremos alguns parâmetros:
+* Clique em “Configurações de arquitetura” e defina a arquitetura do modelo como **SimpleCNN**.
+* Atualize as dimensões de entrada para:
+  - Linhas de entrada: 48
+  - Colunas de entrada: 48
+  - Canais: 3 (já que nossas imagens estão no formato RGB)
+
+  (Você pode mudar para outros números, como 64, 128)
+
+```{figure} ./img/tutorial_images/Figure7.png
+:largura: 600
+:alinhar: centro
+
+Configuração do modelo classificador.
+```
+
+* Clique na aba “Configuração do Conjunto de Dados” e defina a Porcentagem de Treinamento como 0,75, o que reserva 25% dos dados rotulados para validação.
+* Ao clicar em **"Ajustar Classificador"** no Piximi, dois gráficos de treinamento aparecerão: "**Precisão vs. Épocas'' e **"Perda vs. Épocas''. Cada gráfico mostra curvas para os dados de **treinamento** e **validação**.
+* No **gráfico de precisão**, você verá o quão bem o modelo está aprendendo. Idealmente, a precisão tanto do treinamento quanto da validação deve aumentar e permanecer próxima.
+* No **gráfico de perdas**, valores menores significam melhor desempenho. Se a perda de validação começar a aumentar enquanto a perda de treinamento continua caindo, o modelo pode estar com sobreajuste.
+
+Esses gráficos ajudam a entender como o modelo está aprendendo e se ajustes são necessários.
+
+##### 7. **Avaliar modelo:**
+
+🔴 A FAZER
+
+```{figure} ./img/tutorial_images/Figure8.png
+:width: 400
+:align: center
+
+Treinamento e validação do classificador.
+```
+
+* Clique em **“Prever Modelo” (figura 28, seta 1)** para aplicar o modelo que acabamos de treinar. Esta etapa gerará previsões nas células que não anotamos.
+* Você pode revisar as previsões na guia CELLPOSE_CELLS e excluir quaisquer categorias atribuídas incorretamente.
+* Opcionalmente, você pode continuar usando os rótulos para refinar a verdade básica e aprimorar o classificador. Esse processo faz parte da **classificação humana no ciclo**, na qual você corrige e treina o modelo iterativamente com base na entrada humana.
+* Clique em **“Avaliar Modelo” (figura 28, seta 2)** para avaliar o modelo que acabamos de treinar. As métricas de confusão e de avaliação podem ser comparadas com a verdade básica.
+* Clique em "Aceitar previsão (Manter)" para atribuir os rótulos previstos a todos os objetos.
+
+##### 8. **Medição**
+
+Assim que estiver satisfeito com a classificação, prosseguiremos com a medição dos objetos. O objetivo do exercício de hoje é determinar a concentração mínima de Wortmannin necessária para bloquear a exportação de FOXO1A-GFP dos núcleos. Para isso, podemos medir a intensidade total de GFP na imagem ou no objeto.
+
+🔴 PARA FAZER
+
+* Clique em “Medição” no canto superior direito.
+* Clique em Tabelas (Seta 1), selecione Imagem e clique em “Confirmar” (Seta 2).
+* Selecione "MEDIÇÃO" no painel esquerdo. Observe que a etapa de medição pode levar algum tempo para ser processada.
+* Clique em "Categoria" para incluir todas as categorias na medição.
+* Em "Total", clique em "Canal 1" (Seta 3) para selecionar a medição para GFP. Você verá a medição na aba "GRADE DE DADOS". As medições são apresentadas como valores médios ou medianos, e o conjunto de dados completo está disponível ao exportar o arquivo .csv.
+
+```{figure} ./img/tutorial_images/Figure9.png
+:largura: 600
+:alinhar: centro
+
+Adicione medidas.
+```
+
+##### 9. **Visualização**
+
+Após gerar as medições, você pode plotá-las.
+
+🔴 PARA FAZER
+
+* Clique em "PLOTS" (Figura 30, Seta 1) para visualizar as medições.
+* Defina o tipo de gráfico como "Swarm" e escolha um tema de cores de acordo com sua preferência.
+* Selecione "Y-axis" como "intensity-total-channel-1" e defina "SwarmGroup" como "category"; isso gerará uma curva mostrando como a intensidade da GFP varia entre as diferentes categorias (Figura 30, Seta 2).
+* Selecionar "Show Statistics" exibirá a média, bem como os limites de confiança superior e inferior, no gráfico.
+* Opcionalmente, você pode experimentar diferentes tipos de gráfico e eixos para ver se os dados revelam insights adicionais.
+
+```{figure} ./img/tutorial_images/Figure10.png
+:width: 600
+:align: center
+
+Resultados do gráfico.
+```
+
+##### 10. **Exportar resultados e salvar o projeto**
+
+🔴 PARA FAZER
+
+* Clique em "SALVAR" no canto superior esquerdo para salvar o projeto inteiro. Você verá a animação do logotipo do Piximi conforme o salvamento avança <img src="./img/tutorial_images/Piximi_Progress_logo.png" width="140">.
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+##### 11. **Informações de apoio**
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+Confira o artigo do Piximi: [https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.06.03.597232v2](https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.06.03.597232v2)
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+Confira a documentação do Piximi:[Documentação do Piximi](https://documentation.piximi.app/intro.html):[https://documentation.piximi.app/intro.html](https://documentation.piximi.app/intro.html)
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+Relatar bugs/erros ou solicitar recursos [https://github.com/piximi/documentation/issues](https://github.com/piximi/documentation/issues)